Nghiên cứu thăm dò quy trình vi nhân giống hai loài hoa riềng tía và nghệ đỏ làm hoa cây cảnh

1. Đặt vấn đề
     Hoa tươi đóng một vai trò quan trọng trong đời sống tinh thần của con người. Xã hội càng phát triển thì đòi hỏi nhu cầu về sự phong phú đa dạng của các loại hoa ngày càng nhiều. Việt Nam có nguồn tài nguyên di truyền cây nhiệt đới và bán nhiệt đới phong phú (Nguyễn Ngọc Huệ, Nguyễn Quang Minh 2000), trong đó có nhiều giống hoa họ Gừng (Gingiberaceae) mang giá trị thẩm mỹ đẹp. Để phát triển một số giống hoa họ Gừng theo hướng cây cảnh thì có nhiều vấn đề cần giải quyết, trước hết là việc nghiên cứu nhân nhanh tạo ra một số lượng giống lớn. Những kết quả nghiên cứu về các loài cây họ Gừng làm hoa chưa nhiều (Nguyễn Ngọc Huệ và Nguyễn Quang Minh 1999). Việc nghiên cứu quy trình vi nhân nhanh giống hoa họ Gừng là cần thiết. Việc nghiên cứu này không chỉ có mục đích tạo ra số lượng giống lớn có độ thuần và độ sạch cao mà còn có ý nghĩa trong việc bảo tồn nguồn gen bản địa nói riêng và bảo tồn tài nguyên di truyền thực vật nói chung.
2. Nội dung Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
2.1 Nội dung nghiên cứu
      – Đối với nghiên cứu tạo vật liệu cho nhân nhanh
      Thí nghiệm về tác động của thời gian khử trùng đến tỷ lệ sống của mẫu giống
      – Đối với nghiên cứu ở giai đoạn nhân chồi
      + Thí nghiệm về tác động của BAP đến quá trình tạo chồi.
     + Thí nghiệm về tác động của tổ hợp nồng độ tối ưu của BAP và các nồng độ khác nhau của IAA đến quá trình tạo chồi.
      – Đối với nghiên cứu về tái sinh cây hoàn chỉnh.
      + Thí nghiệm về tác động của NAA đến quá trình hình thành rễ.
      – Đối với nghiên cứu ở giai đoạn đưa cây ra vườn ươm.
      + Thí nghiệm về sức sống của cây đưa từ phòng thí nghiệm ra vườn ươm.
2.2. Vật liệu
        Hai giống của hai loài hoa họ Gừng là hoa Riềng tía (Alpinia purpurata), ký hiệu VNZ 151 và hoa Nghệ đỏ (Curcuma domestica), ký hiệu VNZ 56 trong tập đoàn quỹ gen cây họ Gừng của Trung tâm Tài nguyên di truyền thực vật, Viện Khoa học kỹ thuật nông nghiệp Việt Nam.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
       – Các thí nghiệm vi nhân giống được tiến hành tại Phòng thí nghiệm Đa dạng sinh học của Trung tâm Tài nguyên di truyền thực vật.
        – Phương pháp khử trùng: Mẫu cấy ban đầu là chồi cây được tách ra từ những cây mẹ khoẻ mạnh, sạch bệnh. trong tập đoàn cây họ gừng. Thí nghiệm khử trùng ở các thời gian 5, 10, 15, 20, 25 phút trong dung dịch Clorua thuỷ ngân 0,1% ( HgCl2).
        – Phương pháp nuôi cấy:
        + Cường độ chiếu sáng: 2400 lux
        + Nhiệt độ trong phòng nuôi cấy: 20 – 27oC
        + Quang chu kỳ: 12 giờ chiếu sáng -12 giờ tối
        – Bố trí thí nghiệm:
       + Các thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên, mỗi công thức thí nghiệm lặp lại 3 lần, mỗi lần 30 mẫu.
        + Quan sát, theo dõi thí nghiệm thường xuyên bảy ngày một lần
        + Sử dụng phương pháp thống kê sinh học để xử lý số liệu thí nghiệm. 
3. Kết quả và thảo luận
3.1. Tạo vật liệu cho nhân nhanh
       Đây là giai đoạn đưa mẫu từ môi trường tự nhiên vào trong điều kiện nuôi cấy in vitro. Giai đoạn này được coi là khâu kỹ thuật quan trọng tạo tiền đề cho qúa trình nuôi cấy in vitro. Trong giai đoạn này cần đảm bảo yêu cầu: tỷ lệ mẫu nhiễm thấp, tỷ lệ mẫu sống cao, mô tồn tại, phân hoá và sinh trưởng tốt ( Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Lý Anh 1996 ).
       Kết quả nghiên cứu phương pháp khử trùng chồi cây trong các khoảng thời gian khác nhau của giống VNZ 56 và giống VNZ 151 bằng Clorua thuỷ ngân 0,1% được trình bày trong Bảng 1 (sau bốn tuần theo dõi).
Bảng 1. ảnh hưởng của thời gian khử trùng đến tỷ lệ sống của mẫu
 

TT
Thời gian (phút)
Tỷ lệ nhiễm (%)
Tỷ lệ chết (%)
Tỷ lệ sống (%)
Giống VNZ56
Giống VNZ151
Giống VNZ56
Giống VNZ151
Giống VNZ56
Giống VNZ151
1
5
100
100
2
10
43
40
57
60
3
15
3
3
14
14
83
83
4
20
3
3
47
44
50
53
5
25
0
0
70
67
30
33
      Thời gian khử trùng khác nhau có ảnh hưởng lớn đến tỷ lệ sống và tỷ lệ nhiễm của mẫu cấy. ở cùng một nồng độ chất khử trùng nếu để mẫu cấy trong thời gian 5 phút thì tỷ lệ nhiễm cao 100% ở cả hai giống. ở chế độ thời gian 25 phút thì tỷ lệ chết đạt 70% ở giống VNZ 56 và 67% ở giống VNZ 151. Như vậy chế độ khử trùng tối ưu cho cả 2 giống là HgCl2 0,1% trong 15 phút.
3.2. Giai đoạn nhân chồi
       Đây là giai đoạn đánh giá tính ưu việt hay không ưu việt của phương pháp nhân giống in vitro, nó quyết định hệ số nhân của qui trình nhân. Theo Vuglteke (1989) môi trường nuôi cấy có bổ sung nhóm Cytokinin thì có tác dụng kích thích taọ chồi. Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật BAP là Cytokinin có hoạt tính sinh học cao nên thường được sử dụng để thúc đẩy sự phân chia và lớn lên của các mô nuôi cấy. Do đó chúng tôi đã bổ sung BAP vào môi trường MS ( Murashige and Skoog 1962), kết quả thí nghiệm trên 2 giống được trình bày trong Bảng 2 (sau tám tuần theo dõi).
Qua kết quả bảng 2 cho thấy việc bổ sung chất điều tiết sinh trưởng tỏ ra có hiệu quả trong việc tăng hệ số nhân. ở công thức đối chứng không có bổ sung BAP thì hệ số nhân chỉ đạt 2,22 với giống VNZ 56 và 2,83 với giống VNZ 151. Khi tăng nồng độ BAP tới 5 ppm thì hệ số nhân đạt 4,33 với giống VNZ 56 và 6,56 với giống VNZ 151. Tuy nhiên nếu chỉ quan tâm đến hệ số nhân thôi thì chưa đủ vì qua theo dõi chúng tôi thấy ở nồng độ BAP cao ( 5 ppm) cho kết quả hệ số nhân cao nhưng chiều cao chồi trội trung bình lại giảm so với công thức bổ sung BAP ở nồng độ 3 ppm. Các công thức bổ sung hai nồng độ này thì chất lượng chồi kém hơn do quá trình phân hoá tế bào mạnh dẫn đến hiện tượng chồi kém phẩm chất, đã thấy xuất hiện tình ttạng bị dính lá giữa các chồi nhưng rất ít, đó là một trong những biểu hiện của hiện tượng biến dị. Như vậy có thể đi dến kết luận trong giai đoạn nhận nhanh cây hoa họ gừng chỉ nên bổ sung chất điều tiết sinh trưởng ở nồng độ vừa phải, môi trường MS + 3 ppm BAP là công thức thích hợp cho quá trrình nhân nhanh.
Bảng 2. ảnh hưởng của BAP đến quá trình tạo chồi
 

TT
Chỉ tiêu
Công thức
Hệ số nhân
Chiều cao
chồi trội (cm)
Chất lượng chồi
Giống VNZ56
Giống VNZ151
Giống VNZ56
Giống VNZ151
Giống VNZ56
Giống VNZ151
1
ĐC: MS
2,22
2,83
8,78
7,53
+++
+++
2
ĐC +1ppm BAP
3,45
4,72
8,50
7,44
+++
+++
3
ĐC + 2ppm BAP
3,83
5,05
8,42
7,00
++
++
4
ĐC + 3ppm BAP
4,11
6,11
7,80
6,72
++
++
5
ĐC + 4ppm BAP
4,22
6,39
7,71
5,14
+
+
6
ĐC + 5ppm BAP
4,33
6,56
6,90
4,90
+
+
Trung bình
3,69
5,27
CV (%)
21,33
26,70
LSD 0.05
0,28
0,18
(+).   Chất lượng chồi trung bình
(++). Chất lượng chồi tốt
(+++). Chất lượng chồi rất tốt
      Bên cạnh việc nghiên cứu ảnh hưởng riêng rẽ của chất điều tiết sinh trưởng chúng tôi còn nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp các chất điều tiết sinh trưởng đến quá trình nhân nhanh. Kết quả nghiên cứu được trình bày ở Bảng 3 (sau tám tuần theo dõi).
      – Cũng như với thí nghiệm được trình bày trong bảng 2 giống VNZ 151 vẫn cho hệ số nhân cao hơn giống VNZ 56, điều này có thể giải thích là do bản chất di truyền của giống.
      – Với sự có mặt của tổ hợp xytokinin + auxin tỷ lệ mẫu đạt hệ số nhân cao nhất ở tổ hợp 3,0 ppm BAP + 0,5 ppm IAA là 4,78 với giống VNZ 56 và 6,33 với giống VNZ 151.
       – Ở tổ hợp nồng độ cao của chất IAA thì lại làm giảm hệ số nhân đồng thời chất lượng chồi cũng kém hơn.
Bảng 3. ảnh hưởng của tổ hợp nồng độ tối ưu của BAP và các nồng độ khác nhau của IAA đến quá trình tạo chồi
TT
Chỉ tiêu
Công thức
Hệ số nhân
Chiều cao chồi trội (cm)
Chất lượng chồi
Giống VNZ56
Giống VNZ151
Giống VNZ56
Giống VNZ151
Giống VNZ56
Giống VNZ151
1
ĐC: MS + 3ppm BAP
4,11
6,11
7,80
6,82
+++
+++
2
ĐC + 0,3ppm IAA
4,33
6,17
7,91
6,90
++
++
3
ĐC + 0,5ppmIAA
4.78
6,33
8,12
7,11
++
++
4
ĐC + 1,0ppmIAA
4,22
6,17
6,70
5,67
+
+
Trung bình
4,36
6,19
CV (%)
6,74
1,52
LSD 0.05
0,24
0,44
(+).    Chất lượng rễ trung bình
(++). Chất lượng rễ tốt
(+++). Chất lượng rễ rất tốt
       
4. Giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh
    Trong giai đoạn này người ta thường bổ sung vào môi trường nuôi cấy các chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm auxin (NAA, 2,4D…) với nồng độ thích hợp để tạo rễ cho chồi in vitro tạo cây hoàn chỉnh đạt tiêu chuẩn cây ra vườn ươm.
Bảng 4. ảnh hưởng của NAA đến quá trình hình thành rễ
 
TT
Chỉ têu
Công thức
Tỷ lệ ra rễ (%)
Số rễ
trung bình/cây
Chất lượng rễ
Giống VNZ56
Giống VNZ151
Giống VNZ56
Giống VNZ151
Giống VNZ56
Giống VNZ151
1
ĐC: MS
100
100
3,7
3,4
++
++
2
ĐC +0,3ppm NAA
100
100
4,6
4,1
++
++
3
ĐC +0,5ppm NAA
100
100
5,3
4,6
+++
+++
4
ĐC +1,0ppm NAA
100
100
3,9
3,7
+
+
(+).    Chất lượng rễ trung bình
(++). Chất lượng rễ tốt
(+++). Chất lượng rễ rất tốt
       Kết quả sau bốn tuần theo dõi ở Bảng 4 như sau:
     – Đối với hai giống VNZ 56 và VNZ 151 thì chất điều tiết sinh trưởng không có ảnh hưởng nhiều đến tỷ lệ ra rễ của chồi in vitro, thể hiện là ở cả 4 công thức đều đạt tỷ lệ ra rễ là 100%.
     – Số lượng rễ trung bình trên một cây thay đổi tuỳ theo nồng độ của NAA, ở công thức đối chứng không bổ sung NAA số rễ trung bình là 3,7 còn ở công thức bổ sung 0,5 ppm NAA thì số rễ trung bình đạt 5,3 với giống VNZ 56 và 4,6 với giống VNZ151. ở nồng độ 1,0 ppm NAA đã ức chế sự ra rễ của chồi in vitro đồng thời chiều dài rễ cũng giảm đi. Như vậy để tạo cây hoàn chỉnh cho chồi in vitro 2 giống hoa họ Gừng thì môi trường thích hợp là MS + 0,5 ppm NAA.
5. Giai đoạn đưa cây ra vườn ươm
     Đây là giai đoạn cuối cùng của qui trình nhân giống in vitro, nó có ý nghĩa vô cùng quan trọng quyết định khả năng ứng dụng của toàn bộ quá trình nuôi cấy in vitro vào thực tiễn sản xuất (Martinus Nijhoff 1987). Giai đoạn này là chuyển cây từ môi trường nhân tạo sang môi trường tự nhiên, tức là cây phải chyển từ trạng thái dị dưỡng sang trạng thái tự dưỡng. Chính vì vậy việc tìm ra giá thể thích hợp để ra cây là cần thiết. Chúng tôi đã nghiên cứu ảnh hưởng của hai loại giá thể là đất và trấu hun, kết quả được trình bày trong bảng sáu.
Bảng 6. ảnh hưởng của giá thể đến sức sống của cây
TT
Công thức
Tỷ lệ sống (%)
Giống VNZ 56
Giống VNZ151
1
Trấu hun
97
100
2
Đất
83
87
       Qua bảng 6 chúng tôi thấy giá thể có ảnh hưởng nhiều đến tỷ lệ sống của cây in vitro. Giá thể trấu hun tỏ ra có hiệu quả cho tỷ lệ sống cao 100% với giống VNZ 151 và 97% với giống VNZ 56, bởi vì trấu hun là loại giá thể thông thoáng và thoát nước.
4. Kết luận và đề nghị
1. Kết luận
       – Có thể nhân nhanh 2 giống hoa họ gừng bằng phương pháp nuôi cấy mô, từ đó tạo tiền đề cho quá trình sử dụng các nguồn gen đang lưu giư ở Ngân hàng gen in vitro.
        –  Chế độ khử trùng thích hợp nhất cho cả 2 giống hoa họ gừng VNZ 56 và VNZ 151 là HgCl­2 0,1% trong thời gian 15 phút.
       –  Chất điều tiết sinh trưởng có ảnh hưởng nhiều đến hệ số nhân của chồi in vitro trên cả 2 giống VNZ 56 và VNZ 151. Hệ số nhân đối với giống VNZ 56 là 4,78, với giống VNZ 151 là 6,33. Môi trường thích hợp cho giai đoạn nhân nhanh là:
MS + 3,0 ppm BAP + 0,5 ppm IAA + 3% đường + 6,5g agar/lít
        –  Môi trường phù hợp để tạo cây hoàn chỉnh với hai giống VNZ 56 và VNZ 151 là:
MS + 0,5 ppm NAA + 3% đường + 6,5g agar/lít
       –  Giá thể thích hợp trồng cây in vitro ngoài vườn ươm là giá thể trấu hun.
       – Thời gian từ khi đưa một chồi cây vào nuôi cấy in vitro đến khi đưa cây trồng ra ngoài ruộng là 6 tháng.
2. Đề nghị
      – Sử dụng quy trình vi nhân giống để nhân hai loài hoa họ Gừng là hoa Riềng tía và hoa Nghệ đỏ làm hoa cây cảnh.
      – Tiếp tục mở rộng nghiên cứu các loại giá thể trồng ngoài vườn ươm cho hai loài cây họ Gừng.
       – Tiếp tục nghiên cứu sự sinh trưởng và phát triển của hai loài hoa họ Gừng khi trồng ngoài đồng ruộng.
 
Sơ đồ Qui trình vi nhân giống
hoa Riềng tía và Nghệ đỏ
 
Cây mẹ (chồi cây)
 
 
HgCl2 0,1%, 15phút
MS + 3% đường + 6,5g/lít agar
 
Khử trùng    

    
MS + 3ppm BAP + 0,5ppm IAA + 3% đường + 6,5g/lít agar
 
  Nhân nhanh chồi

    
MS + 0,5 ppm NAA + 3% đường + 6,5g/lít agar
 
Cây hoàn chỉnh

 
Giá thể trấu hun
 
Vườn ươm
 

Quy trình vi nhân giống hoa riềng tía và nghệ đỏ

1. Lấy mẫu:
     Chọn những chồi cây có chiều cao khoảng 2 – 3 cm từ những cây mẹ sinh trưởng tốt, không bị sâu bệnh.
2. Khử trùng:
    Chồi cây được cắt và đem rửa sạch, sau đó ngâm trong dung dịch HgCl2 0,1%, thời gian 15 phút trong điều kiện nuôi cấy vô trùng.
3. Nhân nhanh chồi:
    Những chồi đã sống và không bị nhiễm được đưa vào nhân nhanh trong môi trường cơ bản là MS có bổ sung tổ hợp chất điều tiết sinh trưởng 3ppm BAP + 0,5ppm IAA. Thời gian nhân nhanh chồi khoảng 60 ngày.
4. Tạo cây hoàn chỉnh:
     Cụm chồi hình thành trong giai đoạn nhân chồi sẽ được tách ra và cấy vào môi trường MS có bổ sung 0,5 ppm NAA để hình thành rễ tạo cây hoàn chỉnh.
5. Trồng cây ra vườn ươm:
     Cây có chiều cao khoảng 3 – 5 cm, số rễ khoảng 4 – 5 cái được đưa ra trồng trong vườn ươm trên giá thể trấu hun hoặc đất phù sa. Sau 1 tháng chuyển ra trồng ngoài đồng ruộng. 
 
 Các từ viết tắt
 
BAP:                6 – Benzylaminopurine
ĐC:                  Đối chứng
IAA:                 Indole-3-acetic acid
MS:                  Murashige and Skoog
NAA:                Naphtyl acetic acid
PGS, TS Lưu Ngọc Trình, TS Nguyễn Thị Ngọc Huệ, ThS Trần Danh Sửu, KS Hoàng Thị Huệ

Trả lời

Thư điện tử của bạn sẽ không được hiển thị công khai. Các trường bắt buộc được đánh dấu *